Il CEO di Pfizer Albert Bourla ritiene che il mondo intero avrà bisogno di dosi annuali di richiamo COVID-19. Bourla ha dichiarato che vede i colpi regolari come una necessità per evitare varianti future.
Quindi almeno una volta all’anno o più Big Pharma si aspetta che le pecore si rimbocchino le maniche e facciano un’altra iniezione di ossido di grafene. Considerando che Pfizer stima che il non-vaccino genererà trentatré virgola cinque miliardi di dollari di entrate quest’anno, sono sicuro che avranno tutti gli incentivi a continuare a vendere la paura. E con il terzo colpo previsto per settembre, i soldi continueranno senza dubbio ad arrivare.
In sostanza, Pfizer ha dato la mano oggi, come tendono a fare i luciferiani. Con l’annuncio di colpi regolari, Pfizer sta dimostrando che l’iniezione è un sistema operativo, che dovrà essere aggiornato regolarmente.
Anche il concorrente di Pfizer, Moderna, ammette sul proprio sito Web che la funzionalità del suo “vaccino” è più simile a un sistema operativo. “Riconoscendo l’ampio potenziale della scienza dell’mRNA, abbiamo deciso di creare una piattaforma tecnologica dell’mRNA che funzioni in modo molto simile a un sistema operativo su un computer. È progettato in modo che possa collegarsi e giocare in modo intercambiabile con diversi programmi. Nel nostro caso, il “programma” o “app” è il nostro farmaco per l’mRNA, la sequenza unica dell’mRNA che codifica per una proteina.”
Se il vaccino mRNA altera sistematicamente il DNA umano, allora per definizione chiunque riceva il vaccino, inizierebbe a passare da umano a transumano. I medici a favore dei vaccini affermano che l’mRNA si degrada dopo un breve periodo di tempo. Tuttavia, da allora abbiamo appreso che la proteina spike tossica dell’mRNA è già all’interno dell’iniezione, protetta da un lipide di idrogel a base di ossido di grafene, che perfora il nucleo della cellula, trasportando la proteina spike tossica nella cellula. Un processo replicato miliardi di volte.
Hai notato di recente quanti film e programmi TV sono incentrati sul tema degli zombi e dell’imminente “apocalisse degli zombi?” In passato, ho liquidato l’idea come uno stratagemma di marketing per generare entrate e instillare paura. Tuttavia, dopo aver visto numerosi video di pazienti che hanno avuto reazioni avverse al vaccino, sto iniziando a vedere la possibilità di zombi generati dal vaccino.
Considera il libro dell’Apocalisse, capitolo 9, versetto 6, “Durante quei giorni le persone cercheranno la morte ma non la troveranno; desidereranno morire, ma la morte sfuggirà loro”. Ad un certo punto durante la grande tribolazione, le persone cercheranno di suicidarsi, ma falliranno. Com’è possibile, a meno che la persona non sia più completamente umana e si sia trasformata in una sorta di abominio ibrido. Per natura, gli zombi sembrano essere vivi e morti contemporaneamente, eppure incapaci di morire. È questo che illustra la Bibbia?
Tenete a mente le parole del professor Klaus Schwab, fondatore e presidente esecutivo del World Economic Forum. “La fine della quarta rivoluzione industriale porterà a una fusione delle nostre identità fisiche, digitali e biologiche”.
Secondo Celeste Slum, ex dipendente della FEMA e studente di escatologia, il carico utile del vaccino COVID-19 include le cellule del bambino abortite dei maschi caucasici. Se la persona che riceve il vaccino non è un maschio caucasico, danneggerà il loro sistema immunitario sotto forma di stress fisico e psicologico. Inoltre il colpo amplificherà la paura.
Altri ingredienti nella formula del vaccino COVID-19 sono topi e piante umanizzati. I topi umanizzati sono topi geneticamente modificati che hanno sangue umano e un sistema immunitario umano. Iniettato con proteine umane, il sistema vascolare di una pianta umanizzata funziona in modo simile a un sistema circolatorio umano.
Di nuovo, l’idrogel fatto di ossido di grafene. Queste nanoparticelle o piccoli robot hanno le dimensioni di atomi. Attualmente ci sono trentatré diverse classi di nanobot. Hydro-gel è un chip permanente, come una lente a contatto morbida che collega gli esseri umani al cloud. Il chip, delle dimensioni di un chicco di riso, fornisce feedback a un database sui cambiamenti nella chimica del corpo e altri dati biometrici, comprese le emozioni umane. L’idrogel, un’invenzione della DARPA, è una nanotecnologia robotica microscopica, che ha la capacità di smontare o rimontare. Inoltre, l’idrogel ha la capacità di connettersi con l’intelligenza artificiale e altri dispositivi intelligenti.
Pensare in questo modo. Nanobot all’interno del corpo umano che si fondono con il DNA umano originale creando e replicando il proprio DNA sintetico, per fondersi con il DNA umano, producendo un DNA ibrido unico in grado di interfacciarsi con l’Intelligenza Artificiale. Il compito dei nanobot contenuti nell’Hydrogel è di aderire alle tue cellule fino a quando il corpo ignaro non lo assimila. A questo punto l’umano inizia a diventare tutt’uno con i nanobot. Non si sa il momento esatto in cui un umano non è più un umano e diventa un ibrido,
Una delle caratteristiche aggiuntive di Hydrogel è la sua capacità di guarire le ferite all’istante. Potrebbe Hydrogel avere un ruolo nell’adempimento di Apocalisse 13:3? “Una delle teste della bestia sembrava aver avuto una ferita mortale, ma la ferita mortale era stata guarita. Il mondo intero era pieno di meraviglia e seguiva la bestia”.
Celeste afferma che parte della transizione da uomo a ibrido coinvolge i nanobot che formano uno sciame mentre migrano verso il cervello, prendendo infine residenza in ogni crepa e fessura. I nanobot raccolgono l’umidità dal corpo e la usano come agente per crescere. A questo punto la parte biologica originaria di ciò che ci rende umani comincia ad appassire e morire.
Le sostanze chimiche per la sterilizzazione sono presenti anche nel vaccino COVID-19. I bambini del futuro sarebbero stati prodotti nei laboratori, potenziati, potenziati e progettati per diventare tutt’uno con l’IA, creando una nuova classe di servi per l’élite tecnocratica.
Secondo il Dr. Lee Merritt il vaccino COVID-19 non è un vaccino. Un normale vaccino introduce parte del virus reale per dare un calcio al tuo sistema immunitario. Tuttavia, l’iniezione di mRNA contiene un codice sintetico, che attiva le cellule organiche per produrre una proteina spike. Tuttavia, l’mRNA sintetico penetra in ogni cellula del tuo corpo e non se ne va mai. Fondamentalmente l’mRNA è simile a un chip di computer che si fonde con la tua programmazione genetica.
Il Dr. Merritt ha dichiarato: “Negli studi sugli animali, dopo che le iniezioni di mRNA sono state somministrate ai gatti, quando il virus è arrivato di nuovo nel corpo, è arrivato come un cavallo di Troia, non rilevato dal sistema immunitario dei gatti. Il virus si è moltiplicato incontrastato e tutti gli animali coinvolti nell’esperimento sono morti per varie cause. Quello che è successo è che tutti gli animali sono morti… ma non sono morti per il “vaccino”. Quello che sono morti per quello che una volta veniva chiamato “potenziamento immunitario” e ora lo chiamano “anticorpo”. potenziamento dipendente” (ADE).
“Fanno l’RNA e tu ottieni il “vaccino” e te la cavi bene. Ora, sfidi l’animale con il virus contro il quale dovresti essere immunizzato. Quindi quando hanno sfidato quei gatti con SARS-CoV-1, invece di uccidendo il virus o indebolendolo, la risposta immunitaria che hanno costruito nel tuo sistema quando sono usciti e hanno codificato il virus, quindi il virus è entrato nel corpo del gatto come un cavallo di Troia, invisibile dal sistema immunitario del gatto, e poi si è replicato senza controllare e uccise il gatto con una sepsi opprimente e insufficienza cardiaca.E questo accadeva anche nei furetti, succedeva ogni volta che ci provavano.
Vorrei solo sottolineare. Non siamo mai riusciti a superare con successo uno studio sugli animali per questo tipo di virus. Non abbiamo mai fatto questo negli esseri umani prima… Non abbiamo davvero una storia di successi. Questo vaccino è stato distribuito ai centri di distribuzione prima ancora che mostrassero di interessarsi alla FDA che lo approvava. Te ne rendi conto? Non l’avevo mai visto accadere prima”.
Nel video sopra una stazione televisiva di Charlotte riporta che migliaia di lampioni viola difettosi sono stati installati nell’area metropolitana di Charlotte. Innanzitutto i cosiddetti lampioni viola sono infatti luci nere.
Come riconoscere i vaccinati, luce viola e luciferasi a contrasto.
Ora sta cominciando ad avere un senso. Negli ultimi mesi ho cercato di capire come l’élite luciferiana separerà le pecore svasate compiacenti dagli emarginati non accondiscendenti. Naturalmente, la luciferasi contenuta nell’iniezione confermerà che l’individuo ha ricevuto il colpo. Quindi cos’è la luciferasi?
La luciferasi è un enzima che produce una luce e prende il nome ironicamente da The Light Bearer, Lucifer Morning Star. Lucierase viene iniettato sotto la pelle, ma non può essere visto dall’occhio umano. Tuttavia, quando viene scansionato con un’app per smartphone, Luciferase fornirà un codice digitale per confermare che sei stato vaccinato. Luciferase manterrà il tuo libretto di vaccinazione brevettato e convaliderà il tuo ID univoco. A questo punto diventi un prodotto brevettato di proprietà della società che possiede quel brevetto.
Sospetto che nei prossimi sei-dodici mesi i media mainstream annunceranno i benefici di Lucifease e la necessità di non fare nulla, perché è già dentro di te. Ovviamente avrai ancora bisogno del tuo colpo di potenziamento della variante delta per stare un passo avanti al covid mutante.
Un delta è un triangolo. Ad esempio, il delta del Nilo prende il nome dalla sua forma triangolare. Per i massoni il triangolo simboleggia la A maiuscola greca, chiamata anche “Delta splendente”. La base del triangolo rappresenta la durata e i due lati sono rappresentati come uguali qualità di maschio e femmina, luce e oscurità.
All’interno della religione misterica della Massoneria il delta o triangolo è il simbolo dell’Architetto Supremo, che è Lucifero, il Portatore di Luce. Sia il quadrato che il compasso formano un triangolo. un simbolo di stabilità e del mondo degli spiriti. Così il delta è nascosto al nostro mondo materiale. Proprio come la presunta variante Delta è una propaggine del virus covid-19 che non può essere vista.
Il triangolo invertito o delta è il simbolo del primo grado di stregoneria. Il secondo grado più profondo di stregoneria è rappresentato dal triangolo verticale. Streghe e maghi tradizionalmente scrivono i loro nomi, seguiti dal numero di delta conferiti loro livello nel mestiere.
Il non vaccino è in effetti un infuso delle streghe fornito tramite idro-gel, che è un chip permanente, come una lente a contatto morbida che collega gli umani alla “nuvola” di Internet. Hydrogel fornisce feedback a un database sui cambiamenti nella chimica del corpo e altri dati biometrici, comprese le emozioni umane. L’idrogel, un’invenzione della DARPA, è una nanotecnologia robotica microscopica, che ha la capacità di smontare o rimontare. Inoltre, hydro-gel ha la capacità di connettersi con l’intelligenza artificiale, il cloud e altri dispositivi intelligenti. Oltre a monitorare le tue emozioni, l’idrogel saprà se hai assunto droghe illegali o stai per fare qualcosa di irrazionale.
Dopo che l’idrogel, la luciferasi e l’RNA sintetico sono stati iniettati simultaneamente, il corpo inizia a trascrivere l’RNA sintetico, producendo più virus. L’idea è che il corpo comincerà quindi a produrre anticorpi, migliorando la risposta delle cellule T.
Il problema con questo processo è un effetto noto come trasfezione. La trasfezione è il modo in cui vengono creati gli organismi geneticamente modificati o gli OGM. Oppure, ovviamente, frutta e verdura OGM non sono salutari come quelle biologiche. Lo stesso vale per gli esseri umani OGM o gli ibridi umani. La trasfezione cambierà il DNA e il genoma umani. Una volta che la trasfezione diventa stabile, replicherà il genoma. Questo è quando il genoma sintetico diventa una parte permanente del genoma. Gli effetti che ne conseguono si traducono in una mutazione genetica o in quella che è nota come “Gene Drive Technology” o “Gene Extinction Technology”. la capacità di eliminare una specie alla volta. Se può essere fatto a un insetto, può essere fatto a un essere umano.
Pensare in questo modo. Nanobot all’interno del corpo umano si fondono con il DNA umano originale creando e replicando il proprio DNA sintetico, per fondersi con il DNA umano, producendo un DNA ibrido unico in grado di interfacciarsi con l’Intelligenza Artificiale.
Il compito dei nanobot contenuti nell’Hydrogel è di aderire alle tue cellule fino a quando il corpo ignaro non lo assimila. A questo punto l’umano comincia a diventare tutt’uno con i nanobot. Non è noto il momento esatto in cui un umano non è più un umano e diventa un abominio ibrido.
Una delle caratteristiche aggiuntive di Hydrogel è la sua capacità di guarire le ferite all’istante. Potrebbe Idrogel avere un ruolo nell’adempimento di Apocalisse 13:3? “Una delle teste della bestia sembrava aver avuto una ferita mortale, ma la ferita mortale era stata guarita. Il mondo intero era pieno di meraviglia e seguiva la bestia”.
In teoria, parte della transizione da uomo a ibrido coinvolge i nanobot che formano uno sciame mentre migrano verso il cervello, prendendo infine residenza in ogni crepa e fessura. I nanobot raccolgono l’umidità dal corpo e la usano come agente per crescere. A questo punto la parte biologica originaria di ciò che ci rende umani comincia ad appassire e morire. Dalla morte umana nascerà una nascita ibrida.
Nell’iniezione sono presenti anche sostanze chimiche per la sterilizzazione. Il suo scopo è sterilizzare ogni uomo donna e bambino. Il gioco finale per l’élite tecnocratica luciferina è quello di produrre solo bambini nei laboratori che saranno aumentati, migliorati e progettati per diventare un tutt’uno con l’intelligenza artificiale. Questi faranno parte della classe dei servi che serviranno l’élite dalla culla alla tomba.
Prima dell’avvento dell’mRNA sintetico e della nanotecnologia, i vaccini erano chiari con il loro intento. Iniettare una forma debole o decaduta del virus, sperando che il sistema immunitario naturale del corpo produca anticorpi per evitare un futuro attacco virale.
Il vaccino sintetico mRNA è radialmente diverso perché non contiene alcuna forma del virus, ma è in realtà una piattaforma di lancio, che ospita un codice simile a un computer, progettato per ingannare il corpo, aggirare la rete di sicurezza del sistema immunitario e produrre sinteticamente i picchi proteici prevalente nel virus covid-19.
In parole povere, l’RNA fa parte del nostro codice genetico. L’mRNA sintetico crea nuove proteine sintetiche nel nucleo della nostra cellula e poi le sputa fuori dalla cellula. Un processo ripetuto miliardi di volte, all’interno di miliardi di cellule. Il risultato è un DNA sintetico brevettato, di proprietà della società, che possiede il brevetto. La proprietà del DNA viene quindi trasferita dal creatore alla società.
L’argomento avanzato da Big Pharma è che il processo è transitorio e non influenzerà il genoma. Questa è una bugia.
La tecnologia Crispr 9 consente a un enzima Cas9 di agire come forbici molecolari per tagliare il DNA in una posizione specificata dall’mRNA. Ancora una volta, la molecola di mRNA sintetico è il veicolo di trasporto, che consegna il codice al DNA organico. L’mRNA ha la capacità di leggere le istruzioni del DNA umano e di legarsi al DNA che ha tagliato. Simile a un ramo che viene innestato in un albero. L’RNA guida (gRNA) si lega all’enzima Cas 9, che quindi taglierà il DNA. Nel caso della tecnologia Crispr, un ramo sintetico di mRNA viene innaturalmente innestato in un DNA organico umano. I successivi enzimi a trascrizione inversa consentono all’mRNA di produrre un DNA complementare da assorbire nel nucleo e quindi trasportato nel genoma.
A fornire l’energia all’mRNA per trasportare il suo carico utile e penetrare nel nucleo della cellula sono i biosensori sotto forma di idrogel che collegano un essere umano alla nuvola. Hydrogel avrà la capacità di misurare ogni biometria, unica per ogni essere umano. Ogni emozione e pensiero sarà valutato all’interno di un algoritmo degli standard di conformità dei tecnocrati. Con il vaccino mRNA l’RNA sarà consegnato alla cellula tramite idrogel
All’interno dell’idrogel sono contenute particelle magnetiche di dimensioni nanometriche che rispondono al magnetismo e il segnale magnetico 5G, che spinge l’idrogel, che trasporta l’RNA. Fornendo così la propulsione necessaria per penetrare nella membrana cellulare e muoversi attraverso il liquido citoplasmatico contenuto all’interno della cellula. L’RNA contenuto all’interno dell’idrogel perforerà quindi il nucleo e inizierà a replicarsi naturalmente in un filamento attorcigliato di DNA a doppia elica. Ma un DNA che è rivestito artificialmente. Una creazione di RNA e riarrangiamento dei nucleotidi. Produzione di una sequenza artificiale di DNA. Sebbene la sequenza sia artificiale, la codifica è permanente.
Lo scopo dell’iniezione è abbattere una certa percentuale della popolazione mondiale, sterilizzando ogni uomo, donna e bambino. Nella loro visione distopica, i tecnocratici luciferiani immaginano un mondo in cui i bambini vengono creati nei laboratori, potenziati, potenziati e progettati per diventare un tutt’uno con l’intelligenza artificiale. Una classe di servi della gleba che serve l’élite dalla culla alla tomba.
Secondo un rapporto di ricerca pubblicato su medRxiv, una particolare forma di gene della proteina generazionale di Neanderthal ha dimostrato di proteggere gli esseri umani contro il grave COVID-19. Conosciuta come OAS1, la proteina di Neanderthal ha dimostrato che gli esseri umani che possiedono livelli più alti sono meno suscettibili al COVID-19.
Cosa è la proteina Nephilim OAS1 e cosa ha a che fare con il covid-19
L’OAS1 era presente nel genoma degli africani subsahariani ed è ricomparso negli europei emigrati dall’Africa. È stato poi “reintrodotto nella popolazione europea attraverso l’accoppiamento con i Neanderthal vissuti più di 40.000 anni fa”, ha affermato il coautore Brent Richards del Jewish General Hospital e della McGill University di Montreal.
In sostanza, credo che i Neanderthal fossero in realtà i Nephilim, una razza di giganti ibridi, che erano il risultato di angeli caduti che facevano sesso con donne. Neanderthal è un termine conveniente usato dagli evoluzionisti per scartare le ossa giganti di questi abomini uccisi nel diluvio da Dio. È molto più facile per la “scienza” classificare i Neanderthal semplicemente come un altro trampolino di lancio dell’evoluzione dell’uomo moderno.
Chi erano questi angeli caduti? I testi extrabiblici fanno riferimento ad altri duecento angeli conosciuti come angeli “Guardiani”. La loro missione satanica era quella di compromettere il DNA di ogni essere umano sulla terra, in modo che non riflettessero più l’immagine di Dio. Ogni persona contiene un rotolo di DNA che ne determina la fisicità, l’intelletto e le emozioni. Quarantasei cromosomi del padre e della madre formano un set individuale contenente un codice genomico del DNA a doppia elica. Questa testimonianza fisica e registrazione delle vite dei genitori è stata tramandata e preservata dal diluvio. Prima del diluvio, Dio iniziò la distruzione del DNA dei Nephilim mettendoli l’uno contro l’altro attraverso il massacro reciproco.
I Nephilim producevano anche molteplici varietà di chimere e mostri. Il satiro, il grifone e il fauno non erano mutanti immaginari della mitologia greca, ma veri e propri abomini storici. I racconti dei Titani nelle civiltà sumera, egizia e romana sono un’ulteriore prova dell’incursione dei Nephilim prima e dopo il diluvio.
I nefilim sono esseri eterni. Sebbene i loro corpi mortali siano morti nel diluvio, gli spiriti disincarnati esistono oggi come feroci spiriti terrestri noti come demoni, il cui scopo è tormentare e distruggere.
Il Libro di Enoch, capitolo 15, versetti 8-10 dice: “Ora i giganti, che sono stati chiamati sulla terra spiriti maligni, procederanno dalla loro carne, perché sono stati creati dall'alto; dai santi guardiani era il loro inizio e il loro fondamento primario. Spiriti maligni saranno sulla terra, e gli spiriti degli empi saranno chiamati. La dimora degli spiriti del cielo sarà in cielo; ma sulla terra sarà la dimora degli spiriti terrestri, che sono nati sulla terra. Gli spiriti dei giganti saranno come nuvole, che opprimeranno, corromperanno, cadranno, si contenderanno e schiacceranno sulla terra. Causeranno lamenti. Non mangeranno cibo; e avranno sete; saranno nascosti e non si leveranno contro i figli degli uomini e contro le donne; poiché vengono fuori durante i giorni del massacro e della distruzione”.
Questi ibridi di ispirazione satanica hanno consumato tutta la vegetazione, gli animali, le immagini e infine l’un l’altro.
Il Libro di Enoch, capitolo 7, versetto 2-5 dice: "Le donne rimasero incinte e diedero alla luce giganti, alti quattrocentocinquanta piedi. Hanno mangiato le fatiche degli uomini. Poiché non erano in grado di rifornirli, i giganti si fecero coraggio contro di loro e divorarono gli uomini. Cominciarono a peccare contro uccelli, animali, rettili e pesci ea mangiare la carne l'uno dell'altro. E hanno bevuto il sangue”.
Sembra che la prossima mossa dell’élite luciferina sia quella di promuovere la proteina OAS1 come il proiettile d’argento per proteggere l’uomo dal grave COVID-19. Immagina i risultati se il DNA estratto dai resti dello scheletro di un Nephilim si mescolasse con il DNA umano.
Matteo Capitolo 24 Versetto 37 " Ma come furono i giorni di Noè, così sarà anche la venuta del Figlio dell'uomo".
La Columbia Engineering ha annunciato di aver costruito il microchip più piccolo del mondo, di dimensioni inferiori a quelle di un acaro della polvere e visibile solo durante la visualizzazione al microscopio. Aggiungendo un altro livello di intrigo, il team di ingegneri afferma di aver sfruttato la potenza degli ultrasuoni per comunicare con il microchip in modalità wireless.
Il chip è un sistema elettrico autonomo in grado di interagire con altri dispositivi. Poiché le lunghezze d’onda degli ultrasuoni più lente viaggiano alla velocità del suono, 761 miglia all’ora, un’antenna per la comunicazione e l’alimentazione è stata aggiunta alla parte superiore del chip.
In definitiva, l’obiettivo del team di ingegneri della Columbia è integrare microchip iniettabili nel corpo e quindi utilizzare gli ultrasuoni per comunicare con i microchip mentre misurano la biometria del corpo. Pertanto, l’implementazione di un sistema a ultrasuoni remoto assistito da robot basato su 5G potrebbe plausibilmente recuperare le caratteristiche degli ultrasuoni degli organi del corpo, incluso il cervello.
In superficie, l’élite luciferina avviserà le masse che il microchip valuterà la gravità del COVID-19 a distanza e terrà traccia di coloro che non sono conformi all’ultima iniezione di richiamo per combattere la variante più recente e letale.
A partire da lunedì, New York City richiederà la prova della vaccinazione per entrare in ristoranti, palestre e luoghi di intrattenimento al coperto come concerti e cinema. Tuttavia, il municipio non applicherà il mandato fino al 13 settembre affinché le imprese si adattino alle misure draconiane.
Attualmente New York ha due varianti della prima generazione di passaporti vaccinali, l’app COVID Safe, per la città di New York, e l’Excelsior Pass per lo stato di New York. L’Excelsior Pass è il primo passaporto per vaccini rilasciato dal governo nel paese. Dopo aver caricato la prova della vaccinazione, l’app funzionerebbe come un codice QR. E per renderlo più universale, chiunque da qualsiasi stato può caricare l’app.
IBM, uno dei principali attori tecnologici nella futura tecnocrazia, ha creato Excelsior per lo stato di New York e promettono di proteggere tutti i dati personali utilizzando la crittografia e la blockchain. Finora più di dodici stati, tra cui Texas e Florida, hanno vietato la creazione e/o l’applicazione di passaporti per vaccini.
Se più città e stati capitoleranno e adotteranno il passaporto del vaccino dipenderà dall’accettazione della falsa narrativa dei media di una pandemia di COVID-19 in continuo peggioramento. Questo autunno i casi di infezione aumenteranno a causa del jab di mRNA che fornisce una molecola sintetica e inorganica, un dispositivo medico, programmando le tue cellule per sintetizzare gli agenti patogeni sotto forma della proteina spike, che il sistema immunitario dovrà costantemente combattere per il resto della sua vita.
In altre parole, i ricoveri dovrebbero aumentare drasticamente a causa della proteina spike sintetica che agisce come una tossina in ogni organo del corpo. L’élite luciferiana incolperà quindi le ferite e le morti sull’ultima variante immaginaria e sui non vaccinati. La paura e la persecuzione dei non conformi aumenteranno drammaticamente fino a quando la maggior parte si inchinerà e accetterà il colpo come un porto percepito di ultima istanza.
Il 5G sarà implementato come piattaforma di frequenza che altera le vibrazioni, attivando i microchip e i nanobot incorporati, mentre l’uomo si trasforma in un ibrido di argilla e metallo connesso alla rete 5G. Una volta che la microtecnologia entra nel corpo, non può mai essere rimossa e diventa parte del DNA, trasformando un essere umano in un prodotto programmabile e brevettato come un I-phone.
A 60 giga hertz, il 5G può influenzare l’emoglobina, che trasporta l’ossigeno dai polmoni ai tessuti del corpo. Il certificato digitale dimostrerà che hai ricevuto il cosiddetto vaccino e la convalida sarà confermata con un composto che emette luce chiamato Luciferasi, un altro elemento contenuto all’interno dell’iniezione. Il certificato digitale potrebbe essere modificato anche per transazioni valutarie sotto forma di criptovalute, dopo che il denaro è stato ritenuto illegale. Il futuro e il sistema operativo finale conterrà microchip. Dati biometrici personali letti, valutati e caricati nel cloud 24 ore su 24, 7 giorni su 7. L’élite tecnocratica luciferina che conosce ogni tua emozione e pensiero. La vita ridotta a un punteggio di credito sociale e usata come un martello digitale, costringendo il mondo intero a conformarsi alla loro visione distopica.
Alla fine, il microchip sostituirà il passaporto del vaccino e la convalida sarà autonoma all’interno di ogni persona, collegata all’ecografia del 5G.
Il numero 233 è apparso in moltissime testate giornalistiche italiane e internazionali. Italiane soprattutto, perché l’Italia è il paese preso di mira dalle forze del male già da tanti anni. La numerologia è fondamentale per questi farisei serpenti che comandano il mondo, serve a comunicare, a ricordare loro gli insegnamenti della cabala e dell’esoterismo. Pubblico qui un video che riporta una parte dei titoli ‘mistici’ che hanno dominato il panorama delle testate giornalistiche in quanto a decessi riportati:
Ma perché questo numero 233 esoterico avrebbe a che fare con le forze oscure che sarebbero legate al coronavirus e al vaccino presunto nato successivamente? (o precedentemente)
La risposta arriva da Alberto Ferrarini che in un video ci trasmette qualche piccola nozione di esoterismo e simbologia applicata ai numeri, il linguaggio dei nuovi farisei del tempio:
Un messaggio coerente quindi e collegabile agli articoli da me precedentemente riportati sul tentativo delle serpi di modificare il genome umano (se pur imperfetto) divino, matrice che ci renderebbe riconoscibili al creatore al ritorno profetizzato nei testi sacri del cristianesimo cattolico. Il livello di interpretazione degli avvenimenti di oggi (come quelli dello scorso centenario) devono assolutamente avere una chiave di lettura mistica ed esoterica per avere un senso altrimenti la tragedia, oltre che essere tale, rimane anche senza una logica spiegazione.
Rudolf Joseph Lorenz Steiner (Kraljevic, 27 febbraio 1861 – Dornach, 30 marzo 1925) è stato un esoterista e teosofo austriaco.
È stato il fondatore dell’antroposofia,[3] dottrina di derivazione teosofica[3] che concepisce la realtà universale come una manifestazione spirituale in continua evoluzione,[4] che può essere osservata e compresa mediante l'”osservazione animica” (una sorta di chiaroveggenza),[5] e studiata, nella sua unità col mondo fisico, mediante la cosiddetta “scienza dello spirito” o antroposofia, che egli riteneva essere un vero e proprio approccio scientifico alla conoscenza della verità.
Steiner affermava di non rinnegare il metodo scientifico, che però riteneva infecondo perché materialista[Citazioni 1] e di proporne una versione “più completa” (includente il mondo spirituale). Le sue teorie, tuttavia, muovendosi dichiaratamente al di là della scienza, sono considerate pseudoscientifiche.[8][9][10][11][12][13]
Adesione alla Società Teosofica e alla massoneria
Nel 1897 Steiner lasciò Weimar e si trasferì a Berlino, dove divenne proprietario, redattore capo e autore principale della rivista letteraria Magazin für Literatur, impresa che si rivelò un insuccesso, anche a causa della sua presa di posizione a favore di Émile Zola nell’Affare Dreyfus.[19] Steiner cominciò anche a leggere i testi dell’anarchico individualista Max Stirner, ma poi li abbandonò affermando che essi conducevano “nell’abisso” del nichilismo.
Preferì quindi avvicinarsi alla teosofia, dottrina esoterica propugnata dalla Società teosofica, fondata a New York nel 1875, secondo la quale tutte le religioni del mondo conservano soltanto residui parziali di un’unica verità divina conosciuta nelle varie epoche da un numero ristretto di grandi iniziati.[29] L’avvicinamento avvenne nel 1899, allorquando pubblicò sul Magazine un articolo intitolato La rivelazione segreta di Goethe, saggio sulla natura esoterica di una fiaba di Goethe, Il serpente verde. Ne seguì un invito e poi una serie di conferenze alla Società Teosofica dove Steiner esponeva le proprie concezioni spirituali in quanto non gli erano ancora noti i testi della Società Teosofica.[30] Autore di Theosophie. Eine Einführung (Teosofia: un’introduzione) (1904) e conferenziere attivo in tutta Europa, Steiner contribuì alla crescita della sezione tedesca[19] e ne fu segretario fra il 1902 e il 1912.
Nel 1902 assieme a Marie von Sivers fonda la rivista Lucifer il cui nome (come da lui stesso rivelato) non si riferiva all’entità ma all’idea di apportare luce.[31] La rivista poi si sarebbe fusa assieme alla viennese Gnosis divenendo Lucifer-Gnosis. In questa rivista verranno successivamente pubblicate le trascrizioni delle sue conferenze.[32]
A partire dal 1904 Steiner sviluppa le sue attività di conferenziere. Annie Besant (presidentessa della Società Teosofica) lo nomina responsabile della sezione esoterica per Austria e Germania. Nel 1904 Eliza von Moltke diviene una delle allieve predilette di Steiner nella sua scuola,[33] e, tramite lei, conosce personalmente il generale von Moltke il giovane[34]. Nel 1905, Steiner smette di insegnare all’università popolare di Berlino.[19]
Nel 1906John Yarker era ormai succeduto a Giuseppe Garibaldi come Gran Maestro dell’Ordine massonico di Memphis-Misraïm. In quello stesso anno Théodor Reuss, rappresentante di Yarker in Germania, rilascia a Steiner una patente per fondare a Berlino un Capitolo e un Gran Consiglio di Memphis-Misraïm col titolo distintivo di «Mystica Aeterna». Alla fine dell’anno Steiner fa un viaggio in Italia con Marie von Sivers e trascorrono il natale e il capodanno a Venezia. Nel 1907 tiene nuove conferenze.
Nel mese di maggio si svolge a Monaco il congresso teosofico europeo, durante il quale viene rappresentata l’opera Il dramma sacro di Eleusis di Édouard Schuré. Annie Besant e Rudolf Steiner constatano che hanno delle concezioni differenti di quel che dovrebbe essere l’esoterismo. Alla fine di maggio, con il 100° membro affiliato alla Loggia «Mystica Aeterna», Steiner diventa Gran Maestro Deputato, principale dirigente del Rito di Memphis-Misraïm in Germania, e delle Logge sono installate a Berlino, Colonia, Lipsia, Stoccarda e Monaco.
Steiner viaggia in Italia per quattro settimane durante l’estate e durante il ritorno, in settembre, trascorre alcuni giorni a Barr, in Alsazia, ospite di Édouard Schuré. Nel 1908 continua a dare delle conferenze e fa un nuovo viaggio in Italia. Steiner entra assai presto in conflitto con Reuss e diventa indipendente, fondando il suo proprio rito: la «Massoneria esoterica», alla quale sarebbe stato iniziato Édouard Schuré. Questo rito aveva un rituale il cui testo è parzialmente riprodotto nell’opera di Éliphas LéviDogme et Rituel de Haute Magie. Nella sua autobiografia, Steiner minimizza i suoi rapporti con la Massoneria, e con Reuss in particolare. È da notare che Theodor Reuss è stato membro della Società teosofica. Secondo certi autori Steiner sarebbe stato pure iniziato nell’Ordine della Rosacroce esoterica di Franz Hartmann, teosofo a amico di Reuss, che aveva fondato una branca dissidente della Società teosofica in Germania.[19]
Cosa disse di così attuale Rudolf Steiner nel lontano 1917 in una conferenza?
Gli spiriti delle tenebre sono in mezzo a noi, sono qua. Dobbiamo restare in guardia in modo da accorgerci quando li incontriamo, in modo da comprendere dove si trovano. Perché la cosa più pericolosa nel prossimo futuro sarà abbandonarsi inconsciamente a tali influssi, che realmente esistono intorno a noi. Infatti, che l’uomo li riconosca o meno, non fa alcuna differenza per la loro reale esistenza. Ma soprattutto, per questi spiriti delle tenebre sarà importante portare confusione, dare false direzioni in ciò che si sta ora diffondendo in tutto il mondo e per cui gli spiriti della luce continueranno a operare nella direzione giusta. Ho già avuto occasione di mettere in guardia su una direzione sbagliata, che è davvero tra le più paradossali.
Vi ho indicato che i corpi umani si svilupperanno in modo tale che vi potrà trovar posto una certa spiritualità, ma che il pensiero materialista, la cui diffusione è sempre più alimentata dalle indicazioni degli spiriti delle tenebre, opererà in modo da opporvisi con mezzi materiali.
Vi ho detto che gli spiriti delle tenebre ispireranno le vittime di cui si nutrono, gli uomini che abiteranno, persino ad inventare un vaccino per deviare verso la fisicità, fin dalla prossima infanzia, la tendenza delle anime verso la spiritualità. Come oggi si vaccinano i corpi contro questo e quello, così in futuro si vaccineranno i bambini con una sostanza preparata in modo che attraverso la vaccinazione, queste persone saranno immuni dallo sviluppare in sé la “follia” della vita spirituale, follia, ovviamente, dal punto di vista materialistico.
Tutto questo tende in ultima analisi a trovare il metodo con cui si potranno vaccinare i loro corpi in modo che essi NON POTRANNO SVILUPPARE INCLINAZIONI VERSO IDEE SPIRITUALI, ma crederanno per tutta la loro esistenza solo alla materia fisica. Così, come dagli impulsi, che la medicina ha tratto dall’inclinazione all’inganno oggi vaccina contro la tubercolosi, così DOMANI SI VACCINERÀ CONTRO LA DISPOSIZIONE VERSO LA SPIRITUALITÀ.
Con ciò si intende solo dare un accenno a qualcosa di particolarmente paradossale tra le molte altre cose che accadranno in questo ambito in un futuro prossimo e anche più remoto, in modo di creare scompiglio in ciò che deve fluire sulla terra dai mondi spirituali grazie alla vittoria degli spiriti della luce».
Dr. Rudolf Steiner. [La Caduta degli Spiriti delle Tenebre] [O.O.177 conferenza del 27 ottobre 1917]
Date le numerose potenziali applicazioni dell’ossido di grafene (GO) e il suo conseguente rilascio nell’ambiente, questo studio è stato condotto per valutare gli effetti tossici del GO su Artemia franciscana , un organismo modello ben consolidato per studi ecotossicologici marini. I naupli o gli adulti di A. franciscana stadio I sono stati esposti a GO (1-100 μg mL -1 ) fino a 72 ore, il che ha indotto una mortalità significativa solo negli adulti esposti alla concentrazione più alta per 72 ore. La suscettibilità degli adulti alla OB è stata ulteriormente studiata valutando altri biomarcatori di tossicità: già 24 h di esposizione a 100 μg mL -1 GO inducevano una significativa attivazione dell’enzima xenobiotico detossificante e antiossidante glutatione S.-transferasi, mentre altri parametri tossicologici, come la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), l’attività della colinesterasi e il tasso di crescita, non sono stati influenzati anche dopo 72 ore di esposizione. Inoltre, è stata studiata la captazione della GO in relazione all’integratore alimentare: l’accumulo di GO nel tratto digerente era inferiore in presenza di cibo, rispetto agli organismi non nutriti. In conclusione, questo studio evidenzia i deboli effetti tossici della GO sugli adulti di A. franciscana , inferiori a quelli indotti da altri materiali a base di carbonio. Tuttavia, questo suggerisce un possibile impatto ecotossicologico della OB che deve essere ulteriormente studiato.
L’ampia varietà di applicazioni tecnologiche dei materiali a base di grafene (GBM) e il loro conseguente ingresso nel mercato pongono serie preoccupazioni sulla loro sicurezza ambientale. Tuttavia, il loro potenziale impatto ambientale, in particolare sull’ecosistema acquatico, è ancora poco studiato. Per studiare l’effetto ecotossicologico dell’ossido di grafene (GO), come rappresentativo dei GBM, questo studio è stato condotto sull’organismo modello Artemia franciscana per studi ecotossicologici. GO ha mostrato una debole tossicità sugli adulti di A. franciscana , ma non sulle larve, portando alla morte dell’organismo, non associata a stress ossidativo, solo dopo una lunga esposizione ad alte concentrazioni. Questi risultati non possono escludere che GO possa compromettere l’ Artemiapopolazione, con possibili effetti sulla biodiversità dell’ecosistema, Artemia spp. far parte della catena alimentare acquatica.
1. Introduzione
I materiali a base di grafene (GBM) sono una classe di materiali a base di carbonio caratterizzati dalle loro straordinarie caratteristiche meccaniche, ottiche, elettriche e termiche. Le loro proprietà fisico-chimiche li qualificano come nanostrumenti attraenti, trovando potenziali applicazioni in biomedicina e nanoelettronica come nuovi componenti per la terapia fototermica/fotodinamica, l’ingegneria dei tessuti e la somministrazione di geni/farmaci, 1 così come celle chimiche solari e a combustibile, supercondensatori, sensori ultrasensibili e carica/scarica rapida delle batterie, solo per citarne alcune. 2 Tra i GBM, l’ossido di grafene (GO) è stato ampiamente esplorato in diversi campi, in particolare per le strategie terapeutiche cliniche, 1grazie alla facile funzionalizzazione e disperdibilità in soluzioni acquose. L’ampia varietà di possibili applicazioni di GO, lo sviluppo di prodotti commerciali e la relativa generazione di rifiuti pongono il problema dell’immissione di materiale nell’ambiente. Pertanto, è importante studiare l’impatto ecotossicologico del GO. In particolare, le proprietà fisico-chimiche del GO, come l’ampia area superficiale e la presenza di gruppi funzionali reattivi dell’ossigeno ( ad es. , gruppi epossido, idrossile, estere, carbossilico e carbonilico), conferiscono al materiale un’idrofilia superiore rispetto ad altri GBM, 3-7favorendone la dispersione negli ambienti acquatici nonché le interazioni con gli organismi acquatici. Tuttavia, il potenziale impatto della GO sull’ecosistema acquatico, in particolare su quello marino, è stato finora poco chiarito. Di conseguenza, la tossicità del GO sugli organismi acquatici e il rischio associato alla loro esposizione al materiale nelle sorgenti acquatiche meritano di essere studiati a fondo.
È già stato segnalato che questo materiale potrebbe indurre un impatto negativo sugli organismi marini. Ad esempio, è stato dimostrato che GO è stato in grado di ridurre la crescita e la concentrazione di pigmenti fotosintetici nelle alghe del genere Picochlorum . 8 Nel polichete Diopatra neapolitana , il danno cellulare indotto da GO, ha effetti negativi sulla capacità rigenerativa e sulle risposte energetiche alterate. 9 Inoltre, i test in vitro sugli emociti di cozze ( Mytilus galloprovincialis ) hanno mostrato che il GO induce effetti citotossici significativi, con un aumento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e danni alla membrana. 10Inoltre, studi condotti su crostacei, come le larve di Amphibalanus amphitrite 11 e i naupli di Artemia salina , 12-14 , hanno dimostrato la capacità del GO di aumentare la mortalità e la produzione di ROS.
Artemia , genere di crostacei anostracani adattati all’ambiente ipersalino e presente in laghi salati, lagune costiere e saline artificiali, 15 comprende specie comunemente utilizzate negli studi tossicologici ed ecotossicologici, in particolare quelli relativi alla valutazione degli impatti negativi a il livello marino. 16 Le diverse caratteristiche di Artemia spp. renderli organismi modello in questo campo di ricerca. Ad esempio, le specie di Artemia sono adatte alla coltura e al mantenimento in laboratorio, hanno un ciclo di vita breve e un’ampia distribuzione geografica e vi è una buona conoscenza della loro biologia ed ecologia. 15Queste specie sono caratterizzate da più di 15 mute durante il loro ciclo vitale, con quattro stadi di sviluppo principalmente distinguibili (nauplius, metanauplius, giovanile e adulto), e si nutrono di batteri, microalghe e protozoi. 17 I principali predatori di Artemia sono uccelli e corixidi 18 ma questo crostaceo è una fonte di cibo adatta per diversi organismi, come foraminiferi, celenterati, vermi piatti, policheti, cnidari, calamari, insetti, chetognati, pesci e altri crostacei. 19 Artemia franciscana è la specie più abbondante di Artemia , largamente utilizzata anche per scopi di acquacoltura.
Nell’ultimo decennio, Artemia spp. hanno iniziato ad attirare l’attenzione come modello biologico adatto per i test di nanoecotossicità 20 e sono state recentemente introdotte linee guida specifiche dell’Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) per valutare la tossicità acquatica acuta dei nanomateriali mediante una procedura di test standardizzata utilizzando Artemia spp. naupli. 21 Dal 2009 sono stati pubblicati più di 50 studi su Artemia spp. utilizzato come modello di organismo per la valutazione dell’impatto ecotossicologico dei nanomateriali a livello acquatico, inclusi argento, biossido di titanio e vari materiali a base di carbonio, come fullerene, nerofumo, nanopunti di carbonio e grafene. 21Ad esempio, Pretti et al. non hanno trovato mortalità in A. salina nauplii esposti a scaglie di monostrato di grafene incontaminate (fino a 10 μg mL -1 ) per 24 h; tuttavia, dopo 48 ore di esposizione, concentrazioni più basse hanno indotto stress ossidativo, rilevato da un’aumentata attività della catalasi e della glutatione perossidasi. 22 Inoltre, la riduzione dei punti quantici di ossido di grafene ha indotto la mortalità dose- e tempo-dipendente di A. salina nauplii, con un effetto massimo (circa il 50% di mortalità) dopo 48 ore di esposizione alla concentrazione più alta (160 μg mL -1 ). 23
Considerando il possibile futuro rilascio di GO nell’ambiente acquatico durante il suo ciclo di vita industriale, qui abbiamo studiato gli effetti di GO su A. franciscana . L’effetto GO è stato valutato sia sui naupli che sugli adulti, determinando la mortalità dopo 24, 48 e 72 ore di esposizione, così come altri biomarcatori di tossicità, tra cui la produzione di ROS, il tasso di crescita e l’attività di enzimi selezionati (glutatione S- transferasi, come un enzima xenobiotico disintossicante e antiossidante, e la colinesterasi, come marker di neurotossicità). Inoltre, sono stati studiati l’assorbimento e l’accumulo di GO in A. franciscana .
2. Metodi
2.1 Prodotti chimici
GO (batch #GOB067) è stato fornito da Graphenea (San Sebastian, Spagna). La caratterizzazione completa del materiale è stata precedentemente riportata: 24 brevemente, l’analisi elementare ha mostrato valori medi di 59,40 ± 0,10% C, 1,40 ± 0,10% H, 0,07 ± 0,02% N e <36,6% O. La dimensione laterale media, valutata da la diffrazione laser nello slurry GO, era di 15 100 ± 400 nm con una distribuzione dimensionale laterale situata tra 6000 e 30 000 nm. L’analisi di diffrazione dei raggi X (XRD) eseguita su un film secco GO ha rivelato sei strati. Spettri Raman rappresentativi, microscopia a trasmissione elettronica ad alta risoluzione (HR-TEM) e immagini di microscopia elettronica a scansione (SEM) sono riportati nell’ESI †(Fig. S1). Per la caratterizzazione fisico-chimica completa del GO, fare riferimento al nostro precedente studio eseguito con lo stesso lotto di GO. 24 La sintesi di GO è stata effettuata in ambiente acido (H 2 SO 4 ) e la dispersione finale del materiale è stata in acqua. La purificazione è stata effettuata mediante ripetuti lavaggi in acqua distillata, ma l’analisi elementare ha rivelato che una piccola percentuale di S (circa il 2%) rimaneva nel materiale finale, principalmente come SO 4 2− .
2.2 Organismo modello
Cisti disidratate di A. franciscana e prodotti per la schiusa e l’allevamento di questo crostaceo sono stati acquistati da Hobby (Gelsdorf, Germania). Per ottenere larve allo stadio I, circa 300 mg di cisti sono state schiuse in una capsula specifica per l’ incubazione di Artemia in 750 ml di acqua di mare artificiale (per ogni litro di H 2 O deionizzata , 36 g di sale basico di Optimum Sea; Wave) in presenza costante di acqua di mare artificiale luce a 25 °C per 24 h. I sali basici Optimum Sea sono specifici per gli organismi marini e, come dichiarato dal fornitore, sono composti da oltre 70 elementi con le seguenti caratteristiche principali: Ca 2+ = 440 mg L −1 , Mg 2+ = 1300 mg L −1e assenza di nitrati e fosfati. Successivamente, le larve sono state separate dalle cisti non schiuse, trasferite in acqua di mare artificiale fresca e (i) utilizzate per il test di mortalità o (ii) trasferite in un becher e allevate in acqua di mare artificiale per 21 giorni per ottenere adulti di A. franciscana . Durante i primi 10 giorni dalla schiusa, le Artemia sono state alimentate tre volte alla settimana con alimenti liquidi (Liquizell, Hobby; Germania) e, successivamente, solidi (Mikrozell, Hobby; Germania), specifici per la coltura di Artemia . Gli organismi sono stati mantenuti a 25°C con un ciclo luce/buio di 16:8 ore.
2.3 Identificazione genetica di Artemia francescana
L’identificazione della specie Artemia franciscana è stata effettuata utilizzando gDNA estratto da 5 organismi con il kit GenElute™ Blood Genomic DNA (Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Un frammento del gene della subunità I della citocromo c ossidasi (COI) è stato amplificato utilizzando primer LCO1490: 5′-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3′ e HC02198: 5′-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3′. 25La PCR, eseguita in un volume finale di 50 μL, è stata eseguita con 1× PerfeCTa SYBR Green SuperMix (Quantabio Beverly, MA, USA), 0,3 μM di ciascun primer e 18 ng di gDNA, seguendo il profilo termico di contatto come segue: denaturazione iniziale 95 °C per 60 s; 35 cicli con denaturazione a 95 °C per 10 s, annealing a 56 °C per 30 s e allungamento a 72 °C per 20 s più un’estensione finale a 72 °C per 60 s. La PCR è stata controllata utilizzando gel elettroforetico TAE 1,5% e la banda prevista di 710 bp è stata asportata e purificata con il kit di estrazione EZNA® Gel (Omega Bio-tek; Norcross, USA). Le PCR purificate sono state inviate a un servizio esterno per essere sequenziate da Sanger (Eurofins; Amburgo, Germania).
2.4 Test di mortalità
Il test di mortalità è stato eseguito in triplicato su naupli prelevati dopo 24 h dalla schiusa che corrispondono approssimativamente al primo stadio (stadio I), e su organismi adulti (21 giorni). Per ogni trattamento, 5 naupli instar sono stati trasferiti in ciascun pozzetto di una piastra di polistirene da 96 pozzetti contenente 200 µl di GO sospesi in acqua di mare (1, 10 e 100 µg mL −1 ) e incubati per 24, 48 e 72 h a 25° C in un ciclo luce/buio di 16: 8 h, mentre per gli adulti, 50 organismi sono stati trasferiti in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenente 4,5 mL di sospensione GO nelle stesse condizioni. I naupli non sono stati nutriti durante l’esposizione a GO, mentre Artemiagli adulti hanno ricevuto mangime solido 24 ore prima e 24 ore dopo l’esposizione a GO. Dopo l’esposizione a GO, le piastre sono state esaminate sotto uno stereomicroscopio binoculare (Kyowa, Tokyo, Giappone) con ingrandimento 3× per i naupli e ingrandimento 1× per gli adulti. Il numero di gamberetti morti è stato valutato definendo la mortalità in assenza di qualsiasi movimento durante 10 secondi di osservazione secondo Zulkifli et al. 26 I dati sono riportati come % di organismi morti rispetto al numero totale di organismi esposti alla stessa concentrazione di GO.
2.5 Rilevamento ROS
La produzione di ROS negli adulti di A. franciscana è stata valutata dopo 24 e 72 ore di esposizione a GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) utilizzando il test 2′,7′-diclorofluorescina diacetato (DCFDA) (Sigma-Aldrich; Milano, Italia ) in grado di misurare in modo fluorimetrico i radicali idrossile/perossinitrito secondo Zhu et al. 13 In breve, per ogni determinazione, 5 organismi sono stati lavati 3 volte in TRIS-HCl (100 mM, pH 7,5) e omogeneizzati in 1 mL dello stesso tampone per 15 secondi utilizzando un sonicatore ad immersione (processore ad ultrasuoni UP50H; Hielscher, Teltow, Germania ). I campioni sono stati centrifugati a 12000 gper 15 min a 4°C e il surnatante è stato raccolto e conservato a -80°C. Per misurare la produzione di ROS, in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, sono stati aggiunti 20 µl di surnatante e miscelati con 160 µl di tampone fosfato salino (PBS) e 20 µl di DCFDA (concentrazione finale 40 µM). La piastra è stata incubata per 30 minuti a 37 ° C al buio e la fluorescenza è stata letta utilizzando un lettore di micropiastre (Fluorocount, Packard; Germania) a 485 nm e 520 nm (la lunghezza d’onda di eccitazione ed emissione, rispettivamente). Il contenuto proteico è stato misurato utilizzando un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Milano, Italia) e, per ogni campione, i risultati finali sono stati riportati come unità di fluorescenza relativa (RFU) normalizzate su mg di proteine.
2.6 Estrazione enzimatica
Gli enzimi (glutatione S- transferasi e colinesterasi) sono stati estratti da adulti di Artemia secondo Jemec et al. 27 In breve, 50 adulti sono stati esposti a GO (1, 10 o 100 μg mL -1 ) per 24 e 72 ore. Successivamente, gli organismi viventi sono stati raccolti, lavati tre volte con tampone fosfato (50 mM, pH 7 composto da Na 2 HPO 4 e NaH 2 PO 4 ) contenente EDTA (5 mM), sonicati in 240 μL di tampone fosfato (50 mM, pH 7) e centrifugato a 15000 g per 25 min a 4 °C. I surnatanti sono stati raccolti e conservati a -80 °C dopo la quantificazione delle proteine utilizzando il NanoDrop.
2.6.1 Attività del glutatione S-transferasi
Per valutare l’attività della glutatione S- transferasi (GST), sono stati aggiunti 25 μL di surnatante in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, seguiti da 25 μL di l- glutatione ridotto 4 mM (Sigma-Aldrich; Milano, Italia), 2 μL di 50 mM 1-cloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB; Sigma-Aldrich; Milano, Italia) e 48 μL di tampone fosfato di potassio (100 mM, pH 6.5, composto da K 2 HPO 4 e KH 2 PO 4 ). Il bianco è stato preparato allo stesso modo, ma la sonda (CDNB) è stata sostituita con 2 μL di tampone fosfato di potassio. L’assorbanza è stata letta utilizzando un lettore di micropiastre (PowerWaveX, Bio-Tek Instruments Inc.; Vermont, USA) a 340 nm ogni 30 s per 4 min.
2.6.2 Attività della colinesterasi
Per valutare l’attività della colinesterasi (ChE), in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, 50 μL di surnatante sono stati miscelati con 10 μL di acetiltiocolina ioduro 10 mM (Sigma-Aldrich; Milano, Italia), 10 μL di 5 mM 5 ,5′-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) (Sigma-Aldrich; Milano, Italia) e 30 μL di tampone fosfato di potassio (100 mM, ph 7.4). Nel caso del bianco, DTNB è stato sostituito con tampone fosfato di potassio. L’assorbanza è stata misurata a 405 nm ogni minuto per 3 minuti con un lettore di micropiastre (TECAN; Männedorf, Svizzera).
2.6.3 Quantificazione dell’attività enzimatica
L’attività enzimatica è stata espressa in unità enzimatiche (EU), calcolate come segue:dove ε era 9600 M -1 cm -1 e 13 600 M -1 cm -1 rispettivamente per GST e ChE.
L’attività enzimatica è stata riportata come UE per numero di organismi nel campione.
2.7 Contenuto proteico
Il contenuto proteico è stato analizzato per studiare l’effetto GO sulla crescita di A. franciscana . In breve, dopo l’esposizione a GO, gli organismi sono stati raccolti e processati come riportato per l’estrazione enzimatica. Il contenuto proteico nei surnatanti è stato misurato utilizzando uno strumento NanoDrop (NanoDrop 2000; Thermo Scientific; Milano, Italia) a una lunghezza d’onda di 280 nm. I risultati sono stati riportati come mg di proteine normalizzate sul numero di organismi in ciascun campione.
2.8 Assorbimento di GO
Per valutare l’assorbimento di GO da parte di A. franciscana , 10 organismi, alimentati 24 ore prima del trattamento, sono stati esposti a GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) in presenza o assenza di cibo (aggiunto 24 ore dopo l’esposizione a GO ). Dopo 24, 48 e 72 ore di esposizione, gli organismi sono stati fissati con p- formaldeide al 4% (Sigma-Aldrich; Milano, Italia) per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi con acqua distillata, gli organismi sono stati osservati allo stereomicroscopio binoculare (Kyowa; Tokyo, Giappone) ed è stata valutata otticamente la presenza di GO e/o mangime nel lume del tratto intestinale (colore nero e verde, rispettivamente).
2.9 Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state fornite utilizzando il software GraphPad Prism versione 6.00. Le medie e gli errori standard delle medie (SE) di esperimenti indipendenti sono stati calcolati e analizzati con il test t di Student . Per ogni analisi è stata considerata la significatività statistica per valori di p <0,05.
3. Risultati
3.1 Identificazione genetica di Artemia francescana
Poiché sono state mostrate variazioni di sensibilità interspecie verso varie tossine e fattori di stress ambientale tra le specie di Artemia (ad esempio A. franciscana e A. salina ), 28 per evitare imprecisioni tassonomiche, è stata inizialmente effettuata l’identificazione genetica dell’organismo impiegato in questo studio. Infatti, nonostante appartengano allo stesso genere, la corretta identificazione delle specie è di primaria importanza per delineare risposte specifiche al GO che possono variare da specie a specie. Il sequenziamento PCR della regione del gene COI ha confermato l’identità di Artemia franciscana mediante confronto BLASTn con A. franciscanaisolati (ID GenBank: DQ119645 e MK393317), che hanno portato a un’identità di sequenza del 99%. La sequenza condivisa con quella di Artemia salina variava tra l’84,8 e l’84,2%, consentendo l’esclusione della specie A. salina .
3.2 Effetto della GO sulla vitalità di A. franciscana
Per valutare la tossicità della GO verso A. fanciscana , naupli o adulti sono stati esposti a diverse concentrazioni di GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) per 24, 48 e 72 h, o non trattati (0 μg mL -1 ; controlli), e la mortalità è stata valutata allo stereomicroscopio ( Fig. 1 ). Sebbene non sia stata osservata alcuna tossicità GO significativa nei confronti dei naupli a nessuna concentrazione e tempo di esposizione ( Fig. 1a ), è stato osservato un aumento significativo della mortalità (25%) per gli adulti di A. franciscana dopo 72 ore di esposizione alla più alta concentrazione di GO (100 μg mL -1 ), rispetto ai controlli ( p < 0,05) ( Fig. 1b ). La mortalità diI controlli di A. franciscana negli adulti erano bassi (<5%) in ciascuna condizione sperimentale, indicando il benessere degli organismi durante tutte le analisi.
Fig. 1 Mortalità di A. franciscana nauplii (a) e adulti (b) esposti a GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) per 24, 48 e 72 h. I dati sono presentati come % di organismi morti rispetto al numero totale di organismi nel campione e sono le medie ± SE di almeno tre esperimenti. Differenze statistiche: * p <0,05, test t di Student rispetto ai controlli (0 μg mL -1 ).
3.3 Effetto della GO su A. franciscana come produzione di ROS e attività del glutatione S- transferasi
Per chiarire il meccanismo alla base della mortalità indotta da GO osservata negli adulti di A. franciscana , è stata valutata la capacità di GO di indurre stress ossidativo mediante un’aumentata produzione di ROS, utilizzando il test DCFDA. Inoltre , è stata valutata l’attività della glutatione S- transferasi (GST), uno dei principali enzimi xenobiotici disintossicanti e antiossidanti. Rispetto ai controlli non trattati, l’esposizione di adulti di A. franciscana a GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) per 24 e 72 ore non ha indotto alcun aumento significativo della produzione di ROS ( Fig. 2a ). Tuttavia, l’esposizione degli adulti di A. fanciscana alla più alta concentrazione di GO (100 μg mL -1) ha indotto un significativo aumento tempo-dipendente dell’attività GST rispetto ai controlli non trattati (aumenti del 156% e del 264% dopo 24 e 72 h, rispettivamente; p < 0,05) ( Fig. 2b ).
Fig. 2 Stress ossidativo indotto da GO negli adulti di A. franciscana . Produzione di ROS (a) e attività GST (b) in adulti di A. franciscana esposti a GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) per 24 e 72 h. I dati sono presentati come unità fluorescenti relative (RFU) normalizzate su mg di proteine (a) e unità enzimatiche (EU) normalizzate sul numero totale di organismi (b), e sono le medie ± SE di almeno tre esperimenti. Differenze statistiche: * p < 0,05, test t di Student .
3.4 Effetti della GO sulla motilità di A. franciscana e sull’attività della colinesterasi
Durante il test di mortalità, la ridotta motilità degli adulti di A. franciscana è stata associata all’esposizione a GO, in particolare alla concentrazione più alta (100 μg mL -1 ). Questo risultato potrebbe essere correlato a un danno fisico dovuto alla presenza di aggregati di GO e/o agglomerati sopra le appendici natatorie, come osservato dopo 72 ore di esposizione al materiale ( Fig. 3a ). Tuttavia, potrebbe essere correlato anche alla compromissione dei movimenti mediata biochimicamente. Pertanto, è stata valutata l’attività della colinesterasi (ChE), un enzima chiave coinvolto nella regolazione della ricezione dell’acetilcolina nei siti neuromuscolari. Rispetto ai controlli non trattati, non sono stati osservati effetti significativi sull’attività ChE dopo 24 o 72 ore di esposizione a GO (1, 10 e 100 μg mL−1 ) ( Fig. 3b ).
Fig. 3 Immagine rappresentativa di A. fanciscana adulto esposto a 100 μg mL -1 GO per 72 h sotto uno stereomicroscopio (a); le frecce indicano la presenza di aggregati/agglomerati GO. Attività della colinesterasi (b) negli adulti di A. franciscana esposti a GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) per 24 e 72 h. I dati dell’attività della colinesterasi sono presentati come unità enzimatiche (EU) normalizzate sul numero totale di organismi e sono le medie ± SE di tre esperimenti.
3.5 Effetti della GO sulla crescita adulta di A. franciscana
Per valutare gli effetti della GO sul tasso di crescita degli adulti di A. franciscana , gli organismi sono stati esposti al materiale (1, 10 e 100 μg mL -1 ) per 24 e 72 ore. Successivamente, è stata valutata la velocità di crescita misurando il contenuto proteico nel surnatante raccolto dopo centrifugazione degli organismi omogeneizzati ( Fig. 4 ). Rispetto ai controlli non trattati, l’esposizione a GO non ha indotto alcuna differenza significativa nel contenuto proteico in nessun momento dell’esposizione, suggerendo alcun effetto sul tasso di crescita dei gamberetti. Inoltre, il contenuto proteico registrato dopo 72 h di esposizione a GO era significativamente superiore a quello registrato dopo 24 h sia nei controlli non trattati che negli organismi trattati con GO, confermando un tasso di crescita fisiologico di A. franciscana adulti nell’arco di tempo.
Fig. 4 Contenuto proteico negli adulti di A. franciscana esposti a GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) per 24 e 72 h come indice del tasso di crescita. I dati sono presentati come mg di proteine normalizzati sul numero totale di organismi e sono le medie ± SE di cinque esperimenti. Differenze statistiche 24 vs 72 h: * p < 0,05, ** p < 0,01, t- test di Student .
3.6 Assunzione di GO da parte degli adulti di A. franciscana
Il bioaccumulo di GO negli adulti di A. franciscana dopo 24, 48 e 72 h di esposizione a 1, 10 e 100 μg mL -1 del materiale è stato valutato utilizzando uno stereomicroscopio, sia in presenza che in assenza di cibo (è stato aggiunto 24 h dopo l’esposizione a GO). Come mostrato in Fig. 5 , adulti esposti alla più alta concentrazione di GO (100 μg mL -1) accumulato aggregati/agglomerati di GO nero nel lume dell’intestino (frecce nere). L’accumulo di GO nell’intestino sembra essere maggiore negli organismi privi di cibo rispetto agli organismi con libero accesso al cibo. Quest’ultimo ha mostrato la presenza di particelle alimentari verdi (frecce verdi) e solo un leggero accumulo di GO nella parte terminale del tratto intestinale (frecce nere). Come previsto, i controlli non trattati presentavano un intestino vuoto in assenza di cibo o particelle verdi nel lume dopo l’aggiunta di cibo (frecce verdi). Risultati simili sono stati registrati anche dopo 48 ore di esposizione a tutte le concentrazioni di GO. L’assorbimento di GO da parte degli adulti di A. franciscana dopo 24 e 48 ore di esposizione è visibile nell’ESI † (Fig. S2).
Fig. 5 Assorbimento di GO da parte degli adulti di A. franciscana . Immagini rappresentative di adulti A. franciscana esposti a GO per 72 h, in assenza e in presenza di cibo, nonché di controlli A. franciscana non trattati (0 μg mL -1 ). Le frecce nere e verdi indicano rispettivamente GO e cibo nel lume del tubo digerente. Le immagini sono state acquisite allo stereomicroscopio con ingrandimento 1×. Barre della scala: 1 mm.
4. Discussione
GO è un GBM che ha un ampio spettro di possibili applicazioni grazie alle sue peculiari proprietà fisico-chimiche. Tuttavia, alcune evidenze di effetti negativi in diversi organismi invertebrati e vertebrati 29 suggeriscono un possibile impatto ecotossicologico dei GBM. Nell’ambiente acquatico è stato osservato un impatto negativo per le microalghe, 30,31 i crostacei Daphnia magna , 32 Ceriodaphnia dubia 33 e Amphibalanus anfitrite , 11 policheti, 9 e protozoi, 34 nonché embrioni di zebrafish 35,36 e adulti. 37In generale, i nanomateriali a base di carbonio, inclusi i GBM, sono leggermente tossici per la maggior parte degli organismi acquatici e il loro effetto semimassimo (EC 50 ) varia tra 10 e 100 μg mL -1 . Tuttavia, i loro effetti tossici dipendono (i) dal tipo di materiale, poiché le proprietà fisico-chimiche ei metodi di produzione possono modulare la tossicità ( ad es . dimensione, funzionalizzazione e solvente utilizzato per la preparazione); (ii) la sensibilità di ciascuna specie (le più sensibili sembravano essere le alghe, seguite da crostacei, pesci e batteri) e (iii) il tempo di esposizione. 38Inoltre va considerato che il GO si agglomera facilmente in acqua salina e che un aumento della salinità oltre il 10‰ diminuisce la velocità di sedimentazione per la formazione di agglomerati ramificati. Pertanto, nelle acque saline, il GO potrebbe subire alcune trasformazioni che influiscono sui suoi potenziali effetti sugli organismi acquatici. 39
Nel presente lavoro, l’ A. franciscana è stata utilizzata come organismo modello per studiare il possibile effetto ecotossicologico del GO, in prospettiva del suo crescente rilascio futuro nell’ambiente. A. franciscana è stata esposta a GO a concentrazioni (1, 10 e 100 μg mL -1 ) selezionate sulla base dei dati di letteratura sulla tossicità dei nanomateriali a base di carbonio per gli organismi acquatici. 38
Inizialmente, per valutare lo stadio di sviluppo più sensibile alla GO, è stata studiata la mortalità esponendo naupli (instar I) o adulti di A. franciscana a GO (1, 10 e 100 μg mL -1 ) per 24, 48 e 72 h. La GO ha indotto un debole ma significativo aumento della mortalità (25%) solo negli adulti di A. franciscana esposti alla massima concentrazione di materiale per 72 h, dimostrando che la sensibilità di questa specie alla GO è influenzata dallo stadio di sviluppo. In letteratura è riportata una mortalità bassa ma significativa (circa il 10%) per nauplii di A. franciscana stadio I esposti per 24 h al nerofumo, a partire da una concentrazione di 100 μg mL -1 . 16Un tasso di mortalità simile è stato osservato nelle stesse condizioni di A. salina stadio I naupli esposti a nanotubi di carbonio a parete multipla ossidati, con una concentrazione letale per il 50% degli organismi esposti (LC 50 ) maggiore di 600 mg mL -1 . 40 Tuttavia, il nostro studio non ha mostrato mortalità significativa di naupli di stadio I di A. franciscana esposti fino a 100 μg mL -1GO per 72 h, suggerendo una tossicità inferiore di GO rispetto a quella di altri materiali a base di carbonio, come il nerofumo o i nanotubi di carbonio a parete multipla ossidati. Inoltre, non si può escludere che la bassa mortalità dei naupli esposti al GO possa essere dovuta, almeno in parte, alle condizioni di digiuno in cui sono stati esposti al GBM. D’altra parte, non si può escludere che questa condizione possa implicare una mortalità sopravvalutata, poiché il digiuno potrebbe aumentare la sensibilità dell’organismo agli stimoli stressanti. Pertanto, è ragionevole ipotizzare che i naupli siano meno sensibili agli effetti tossici del GO rispetto agli adulti.
Per quanto a nostra conoscenza, non sono riportati dati di letteratura che confrontino gli effetti della GO verso lo stadio larvale e quello adulto dell’Artemia . La nostra scoperta è in accordo con studi precedenti che dimostrano che i naupli di Artemia allo stadio I sono più resistenti ad alcuni xenobiotici, come reagenti o elementi chimici inorganici (rame), rispetto agli stadi più sviluppati. 41,42 Questo riscontro è stato registrato anche per A. salina esposta al fullerene (C 60 ): i naupli di stadio I erano più resistenti a questo materiale carbonioso, mentre gli adulti erano più sensibili degli organismi a stadi di sviluppo inferiori, come i naupli di stadio 2, metanauplii (fino a 96 h dopo la schiusa) e zoea (fino a 7 giorni). 43In particolare, in linea con la nostra osservazione, i pochi dati di letteratura sulla tossicità del GO verso A. salina , limitati allo stadio larvale, mostrano un aumento della mortalità dei naupli di Artemia instar I solo a concentrazioni di GO superiori a 100 μg mL -1 . 12-14 La resistenza delle larve rispetto agli adulti è probabilmente dovuta a differenze morfologiche e funzionali e stati metabolici. Ad esempio, le larve instar I mancano di formazioni anatomiche critiche ( es . bocca e ano), che iniziano a svilupparsi allo stadio II, limitando la possibilità di ingestione e il conseguente bioaccumulo di GO.
La mortalità di Artemia spp. esposti ai nanomateriali a base di carbonio dipende non solo dal loro stadio di sviluppo, ma anche dal tipo di nanomateriale, dalle modalità della sua produzione e dalla sua funzionalizzazione. Infatti, la potenza letale del nerofumo verso i naupli di stadio II di A. franciscana dopo 24 ore di esposizione (LC 50 = 370 μg mL -1 ) era superiore a quella del nerofumo funzionalizzato mediante l’introduzione di gruppi aril-carbossilato dal para- ammino benzoico acido (LC 50 = 1000 μg mL -1 ). 16 Per quanto riguarda i metodi di produzione, Kim et al. differenze osservate nella mortalità di A. franciscananaupli di stadio I esposti per 24 e 48 ore a nanopunti di carbonio prodotti con lo stesso metodo sintetico e precursori, ma utilizzando solventi diversi. 44
Considerando che, nel nostro studio, la GO ha indotto una mortalità lieve, ma significativa, solo negli adulti di A. franciscana , solo gli organismi in questa fase di sviluppo sono stati studiati per la loro suscettibilità alla GO, valutando altri biomarcatori e parametri di tossicità. Uno dei principali meccanismi di tossicità da GBM sembra essere un aumento della produzione di ROS e il conseguente stress ossidativo, come precedentemente dimostrato in cellule umane esposte a GO. 45,46 A causa delle loro proprietà chimiche, i ROS sono reattivi con diverse molecole biologiche, causando danni ossidativi di proteine, lipidi e DNA. 47 Tali effetti sono stati registrati anche in A. salinae altri organismi esposti a nanomateriali a base di carbonio, tra cui GO, attraverso la valutazione della produzione di ROS e l’attività di enzimi antiossidanti come biomarcatori dello stress ossidativo. 12,13,48 L’enzima antiossidante considerato in questo lavoro è il GST, un enzima multifunzionale coinvolto nella disintossicazione da xenobiotici e ROS, 49 anche nell’Artemia . 50,51 L’attività degli enzimi di disintossicazione può essere alterata in risposta agli xenobiotici, rendendoli idonei marker di stress da xenobiotici 52 e l’induzione di GST fa parte di un meccanismo di risposta adattativa allo stress chimico, ampiamente distribuito negli organismi viventi. 53Negli organismi acquatici, l’attività del GST può essere aumentata dall’esposizione a diversi xenobiotici, inclusi contaminanti ambientali come pesticidi e organofosfati. 54
Quindi, è stato valutato il possibile ruolo dello stress ossidativo nella mortalità degli adulti di A. franciscana indotta da GO. Nonostante il GO non abbia indotto alcun aumento significativo della produzione di ROS fino a 72 ore di esposizione, la sua concentrazione più alta (100 μg mL -1 ) ha causato un significativo aumento dell’attività GST dipendente dal tempo, rilevabile già dopo 24 ore di esposizione e diventando più pronunciato dopo 72 ore. h. Questo risultato e l’evidenza che la più alta attività GST è stata registrata nelle stesse condizioni di esposizione al GO che inducono mortalità di A. franciscana adulti (100 μg mL -1 a 72 h), suggeriscono un possibile ruolo di questo enzima nel tentativo di disintossicare il materiale e/o scavenging ROS. Tuttavia, dato che molti enzimi antiossidanti sono presenti inArtemia ( cioè catalasi, glutatione perossidasi, superossido dismutasi e altri), non si può escludere che anche altri sistemi antiossidanti intracellulari possano contribuire alla detossificazione dei ROS, oltre al GST. Nonostante l’aumentata attività GST indotta dal GO e l’evidenza che nessuna delle condizioni di esposizione (comprese quelle che inducono mortalità) abbia causato un aumento significativo dei ROS, possiamo ipotizzare che la morte per Artemia possa non essere associata allo stress ossidativo, escludendo quindi i ROS da i meccanismi di tossicità GO in questo organismo. I nostri risultati sono in accordo con un aumento dell’attività GST indotta da GO in altri organismi acquatici, come Crossostrea virginicadopo una lunga esposizione (14 giorni), che suggerisce una up-regulation degli enzimi di disintossicazione come risposta di difesa per contrastare lo stress ossidativo causato dalla GO. 55 Tuttavia, contrariamente alle nostre osservazioni, Zhu et al. hanno riportato un leggero ma significativo aumento della produzione di ROS e una ridotta attività GST nel primo stadio larvale di A. salina esposta a 100 μg mL -1 GO per 24 h. 13 Questa discrepanza potrebbe essere dovuta all’uso di differenti stadi di sviluppo o differenti Artemiaspecie e/o alle differenze fisico-chimiche tra i due GO. Sulla base della caratterizzazione fisico-chimica disponibile, il materiale utilizzato da Zhu era più piccolo e sottile (dimensione fino a 3 μm; numero di strati < 3) rispetto al GO utilizzato in questo studio (dimensione laterale media di circa 15 μm; numero di strati = 6). Tuttavia, non sono disponibili dati di analisi elementare, in particolare la quantità di atomi di O. Poiché la quantità di atomi di O è una caratteristica chiave che influenza la tossicità del GBM, non è possibile estrapolare ulteriori considerazioni sulla relazione struttura-attività.
Dopo l’esposizione a GO, è stata osservata anche una diminuzione della motilità negli adulti di A. franciscana , in particolare alla concentrazione più alta (100 μg mL -1 ). Per valutare se questo effetto fosse correlato a una possibile neurotossicità mediata da fattori biochimici che porta a una ridotta motilità dell’organismo, è stata valutata l’attività di ChE come enzima chiave coinvolto nell’idrolisi del neurotrasmettitore acetilcolina. La ChE, in particolare l’acetilcolinesterasi, svolge un ruolo chiave nella regolazione del sistema di segnalazione colinergico e nel mantenimento di una regolare funzione neuromuscolare. Questo enzima può essere inibito da xenobiotici neurotossici, portando ad un aumento del livello di acetilcolina nella sinapsi con conseguente compromissione della funzione neuromuscolare. 56Tuttavia, non sono state osservate differenze significative in questa attività enzimatica dopo l’esposizione di adulti di A. franciscana a GO. Questo risultato è in linea con uno studio precedente che mostrava che GO (100 μg mL -1 ) non ha modificato l’attività ChE nei naupli di Artemia dopo 48 ore di esposizione. 12 Queste osservazioni suggeriscono che la ridotta mobilità dell’Artemia non è correlata alla ridotta attività ChE come effetto biochimico mediato innescato dalla GO, ma piuttosto al blocco fisico degli organismi da parte della GO. Questa ipotesi è corroborata dalla presenza di aggregati/agglomerati di GO al di sopra del corpo dell’Artemia , che probabilmente ostacolano la motilità di questi organismi.
Ulteriori esperimenti per indagare gli effetti del GO sulla crescita di A. franciscana sono stati effettuati valutando il contenuto proteico negli organismi esposti al materiale. Infatti nel crostaceo Daphnia magna il contenuto proteico è considerato un buon indicatore dello stato nutrizionale e riflette le condizioni fisiologiche dell’organismo. Per questo motivo questo parametro viene utilizzato come indicatore delle condizioni di stress e può essere utilizzato per valutare gli effetti tossici dei contaminanti ambientali. 57 Il contenuto proteico totale in Artemiariflette le condizioni metaboliche dell’organismo, e di conseguenza l’esposizione a uno xenobiotico potrebbe influenzare il livello proteico in risposta allo stress e alla perdita di energia, come mostrato dopo l’esposizione a nano-sferule di polistirene. 58 Tuttavia, i nostri risultati mostrano che il contenuto proteico di A. franciscana non è stato significativamente influenzato dall’esposizione a qualsiasi concentrazione di GO per 24 e 72 ore, suggerendo alcun effetto significativo sul tasso di crescita di questo organismo.
Come fase finale, abbiamo studiato se gli effetti tossici della GO sugli adulti di A. franciscana potrebbero essere correlati all’ingestione di questo materiale e se il cibo potrebbe avere un ruolo nella modulazione dell’ingestione di GO. La capacità di Artemia sp. per ingerire diversi tipi di nanomateriali, come nanotubi di carbonio, 40 fiocchi di monostrato di grafene incontaminati, 22 punti quantici di ossido di grafene, 23 nero di carbonio 16 e GO ( rif. 13 ) è stato già descritto. Va comunque segnalato che, in ambienti naturali, A. franciscana non è esposta esclusivamente alla GO, ma più verosimilmente anche alla sua alimentazione fisiologica ( es.microplancton). Questo presupposto ci ha portato a ipotizzare che la bassa tossicità del GO osservata nel nostro studio potesse essere correlata, almeno in parte, alla sua ridotta assunzione e di conseguenza ad un ridotto livello di esposizione a questo materiale, dovuto alla presenza di cibo. Pertanto, la presenza di GO nel tratto digestivo degli adulti Artemia è stata verificata in presenza o assenza di cibo. I gamberetti sono stati in grado di ingerire GO, ma quando gli organismi sono stati nutriti con i loro nutrienti fisiologici, la presenza di GO nel lume del tubo digerente è diminuita rispetto al cibo. Pertanto, la presenza di cibo potrebbe ridurre l’esposizione dell’organismo al GO per ingestione con conseguente attenuazione del suo effetto tossico.
Conclusioni
Il presente studio ha mostrato un debole effetto tossico del GO su A. franciscana , un organismo modello acquatico utilizzato per studi ecotossicologici. Gli organismi allo stadio adulto erano più sensibili di quelli allo stadio I dei naupli. Nello specifico, il GO ha aumentato significativamente la mortalità degli adulti del 25% solo alla concentrazione più alta (100 μg mL -1 ) e 72 ore di esposizione. La stessa concentrazione di GO ha indotto un aumento tempo-dipendente dell’attività GST, suggerendo l’attivazione dell’enzima di disintossicazione. Tuttavia, altri parametri biochimici, come la produzione di ROS, l’attività ChE e il contenuto proteico, non sono stati influenzati negli adulti di Artemia esposti a GO fino a 72 h. Pertanto, GO ha un impatto negativo, sebbene debole, su A. franciscanaadulti, inferiore a quello di altri materiali a base di carbonio. Considerando che gli effetti tossici del GO si osservano solo a concentrazioni molto elevate e lunghi tempi di esposizione, possiamo ipotizzare un basso impatto ecotossicologico del nanomateriale su questo organismo bersaglio. Infatti, 100 μg mL -1 è una concentrazione di GO piuttosto elevata e la mancanza di dati affidabili sul livello di contaminazione da GBM nell’ambiente acquatico non consente di considerarlo un possibile livello di esposizione per gli organismi acquatici. In ogni caso, non si può escludere che un tale livello di esposizione al GO possa verificarsi accidentalmente, come nel caso di rilascio improvviso di enormi quantità di nanomateriale in un lasso di tempo limitato. Questa ipotesi suggerisce che anche se l’impatto ecotossicologico di GO su A. franciscanapuò essere basso in situazioni particolari, questo nanomateriale potrebbe influenzare questo organismo come parte della catena alimentare nel sistema acquatico. Non si può quindi escludere che una diminuzione, anche modesta, della popolazione di Artemia conseguente agli effetti della OB possa incidere negativamente sulla disponibilità di cibo per i predatori. Inoltre, l’eventuale accumulo del nanomateriale in Artemia potrebbe anche portare ad effetti tossici in altri organismi conseguentemente al bioaccumulo di GO lungo la catena alimentare. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi su altri organismi acquatici per ampliare la conoscenza dell’impatto ecotossicologico del GO.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla convenzione di sovvenzione Graphene Flagship Core 2 e Core 3 (rispettivamente n. 785219 e 881603,). Parte di questo lavoro è stato svolto nell’ambito del programma di unità di eccellenza Maria de Maeztu dell’Agenzia di ricerca statale spagnola – Grant No. MDM-2017-0720. M. Prato è destinatario della Cattedra AXA di Carbon Bionanotechnology (2016-2023). Gli autori sono grati al gruppo di Genomica Applicata e Comparata del Prof. Alberto Pallavicini (Università di Trieste, Dipartimento di Scienze della Vita) per il prezioso aiuto nell’analisi genetica.
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Nota
† Disponibilità di informazioni supplementari elettroniche (ESI). Vedi DOI: 10.1039/d0en00747a
Uno degli scopi del jab al grafene è connettere gli esseri umani all’Internet Of Things e all’intelligenza artificiale.
Il grafene si trova nella grafite. I cristalli formati dal grafene hanno la capacità di produrre un film continuo, capace di conduttività. Elemento trasparente del carbonio, il grafene ha un legame strutturale più forte di un diamante e tuttavia cento volte più flessibile del silicio. Il grafene è una sostanza impermeabile fatta di plasmoni, che migliorano le interazioni luce-materia più degli elettroni tipici.
L’applicazione e i vantaggi del grafene sono sbalorditivi. Ad esempio, le finestre in grafene potrebbero funzionare anche come pannelli solari, fornendo il fabbisogno energetico di ogni edificio del mondo. Veicoli, navi e aerei in grafene trasformati in magazzini autogeneranti di elettromagnetismo illimitato. Rivestindo ogni oggetto fisico con una pellicola di grafene, i transumanisti immaginano l’avvento dell’Internet Of Things.
Trilioni di nanobot di polvere intelligente in grado di rilevare luce, temperatura, magnetismo, sostanze chimiche e vibrazioni. Operare su una rete di computer Wi-Fi wireless e trasmettere la sua identificazione univoca a radiofrequenza.
Wuhan è stato il beta test per l’attivazione di nanobot metallici di polvere intelligente tramite la rete 5G? Ed è solo una coincidenza che l’onda 5G sia nota come onda “V”, come nel virus? A 60 giga hertz, il 5G può influenzare l’emoglobina, che trasporta l’ossigeno dai polmoni ai tessuti del corpo.
I nanobot di polvere intelligente contenuti nel vaccino mRNA potrebbero essere attivati dalle onde 5G, stimolando i nanobot dormienti nei corpi dei colpiti. Consentendogli di digitalizzare internamente tramite i nanobot autoreplicanti. Gli esseri umani si sono trasformati in portatori di magnetismo. La necessità di portare un passaporto del vaccino nello smartphone è stata eliminata, poiché il corpo ora ibrido di metallo e argilla diventa un trasmettitore della convalida del passaporto del vaccino.
Attualmente, il clamore riguarda l’individuazione di chi ha ricevuto e non ha ricevuto il vaccino. Un sistema basato sul sistema dell’onore, che la maggior parte ignorerà. Essenzialmente il jabbed e un jabbed ora si mescolano, con grande dispiacere delle pecore compiacenti. Uno scenario caotico intenzionale è stato imposto al mondo. O più precisamente, problema, reazione, soluzione. Il problema è come sapere chi ha preso il colpo e chi no? La reazione delle pecore è la rabbia e la richiesta di una risoluzione. La soluzione è la risonanza magnetica o più comunemente noto come scanner MRI.
Il corpo umano è composto principalmente da acqua contenente atomi di idrogeno e ossigeno. Al centro di ogni atomo c’è un protone, che funziona come un magnete ed è sensibile a qualsiasi campo magnetico. A riposo, le molecole d’acqua sono disposte casualmente, ma quando esposte a uno scanner MRI, il primo magnete fa sì che le molecole d’acqua si allineino in una direzione e il secondo magnete spinge le altre molecole a stabilirsi in un’altra. Ora mescola nanobot di polvere intelligente e uno scanner MRI potrebbe rilevare qualsiasi campo magnetico innaturale emanato dal corpo. Analogamente alla funzionalità dei metal detector aeroportuali, gli scanner MRI mobili potrebbero essere installati in ogni punto di ingresso di ogni azienda, scuola e ospedale del paese.
Contenuti all’interno dell’idrogel di ossido di grafene, i nanobot di polvere intelligente sono attivati magneticamente dal segnale 5G e spingono l’idrogel contenente l’RNA. Questo meccanismo fornisce la propulsione necessaria per penetrare nella membrana cellulare e muoversi attraverso il liquido citoplasmatico contenuto all’interno della cellula. L’RNA perforerà quindi il nucleo e inizierà a replicarsi naturalmente in un filamento attorcigliato di DNA a doppia elica. Ma un DNA che è rivestito artificialmente. Una creazione di RNA e riarrangiamento dei nucleotidi. Produzione di una sequenza artificiale di DNA. Sebbene la sequenza sia artificiale, la codifica è permanente. Il sistema immunitario naturale del corpo passerà quindi tutto il tempo a combattere la proteina spike sintetica, che continua a replicarsi senza sosta.
Il gioco finale per l’élite luciferiana è controllare la classe restante della gleba da un computer bestiale quantistico centralizzato. Ricerche web, contatti, social media, pensieri ed emozioni verranno caricati in una mente collettiva alveare. I modelli algoritmici segmentati prediranno con precisione il comportamento futuro. Sarà un Nuovo Ordine Mondiale singolare, collettivo, universale, spiritualmente inserito nella matrice di Lucifero. Conoscenza condivisa senza pensieri o opinioni individuali. Conformità acritica che crea una singolarità tecnologica dell’intelligenza collettiva. Una tribolazione tecnocratica di sette anni.
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